Lilin Kecil: TPHA

PEMERIKSAAN TPHA

(Treponema Pallidum Hemaglutination Assay)

1.1 Tujuan

1. Mahasiswa dapat melakukan pemeriksaan TPHA

2. Mahasiswa dapat mendeteksi adanya antibody terhadap Treponema palidum dalam serum pasien secara kualitatif dan semi-kuantitatif

1.2 Metode

Metode yang digunakan adalah indirek hemaglutinasi

1.3 Prinsip

Antibodi spesifik untuk T.pallidum yang ada di dalam serum pasien akan beraglutinasi dengan awetan eritrosit burung yang terdapat dalam reageant Plasmatec TPHA yang telah dilapisi komponen antigenik patogen T.pallidum (Nichol Strain) dan menunjukkan pola aglutinasi pada sumur mikrotitrasi.

1.4 Dasar Teori

Pemeriksaan Treponema Pallidum Hemagglutination Assay (TPHA)

Treponema Pallidum Hemagglutination Assay (TPHA) merupakan suatu pemeriksaan serologi untuk sifilis dan kurang sensitif bila digunakan sebagai skrining (tahap awal atau primer) sifilis. Manfaat pemeriksaan TPHA sebagai pemeriksaan konfirmasi untuk penyakit sifilis dan mendeteksi respon serologis spesifik untuk Treponema pallidum pada tahap lanjut atau akhir sifilis. Untuk skirining penyakit sifilis biasanya menggunakan pemeriksaan VDRL atau RPR apabila hasil reaktif kemudian dilanjutkan dengan pemeriksaan TPHA sebagai konfirmasi (Vanilla, 2011).

TPHA merupakan tes yang sangat spesifik untuk melihat apakah adanya antibodi terhadap treponema. Jika di dalam tubuh terdapat bakteri ini, maka hasil tes positif. Tes ini akan menjadi negatif setelah 6 - 24 bulan setelah pengobatan. Bakteri-bakteri yang lain selain keluarga treponema tidak dapat membuat hasil tes ini menjadi positif (Anonim, 2013).

Pemeriksaan TPHA dilakukan berdasarkan adanya antibodi Treponema Palidum yang akan bereaksi dengan antigen treponema yang menempel pada eritrosit sehingga terbentuk aglutinasi dari eritrosit-eritrosit tersebut (Vanilla, 2011).

Keunggulan metode TPHA untuk pemeriksaan Sifilis dibandingkan metode lain:

1. Teknik dan pembacaan hasilnya mudah, cukup spesifik dan sensitive (dapat mendeteksi titer – titer yang sangat rendah)

2. Bakteri lain selain dari family Treponema tidak dapat memberikan hasil positif

Namun, metode TPHA memiliki beberapa kekurangan, antara lain:

1. Harganya mahal

2. Pengerjaannya membutuhkan waktu inkubasi yang lama, hampir 1 jam.

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pemeriksaan TPHA antara lain :

1. Jangan menggunakan serum yang hemolisis karena dapat mempengaruhi hasil pemeriksaan.

2. Serum atau plasma harus bebas dari sel darah dan kontaminasi mikrobiologi

3. Jika terdapat penundaan pemeriksaan, serum disimpan pada suhu 2-8⁰C dimana dapat bertahan selama 7 hari dan bila disimpan pada suhu -20⁰C, serum dapat bertahan lebih lama.

4. Serum atau plasma yang beku sebelum dilakukan pemeriksaan harus dicairkan dan dihomogenkan dengan baik sebelum pemeriksaan.

5. Reagen harus disimpan pada suhu 2-8⁰C jika tidak digunakan dan jangan disimpan di freezer.

6. Uji TPHA menunjukkan hasil reaktif setelah 1-4 minggu setelah terbentuknya chancre.

7. Dalam melakukan pemeriksaan harus menyertakan kontrol positif dan kontrol negatif

1.5 Alat, Bahan, dan Reagen

A. Alat

1. Mikropipet 190 µl, 10 µl, 25 µl, dan 75 µl

2. Microplate

3. Yellow tip

B. Bahan

1. Serum

C. Reagen

1. Plasmatec TPHA Test Kit mengandung:

- R1 : Test sel

- R2 : Control sel

- R3 : Diluent

- R4 : Control positif

- R5 : Control negatif

1.6 Langkah Kerja

A. Uji Kualitatif

1. Alat dan bahan disiapkan

2. Setiap komponen kit dan sampel dikondisikan pada suhu kamar.

3. Semua reagen dihomogenkan perlahan

4. Diluents ditambahkan sebanyak 190 µl dan sampel ditambahkan sebanyak 10µl pada sumur 1 lalu dihomogenkan

5. Campuran pada sumur 1 dipipet sebanyak 25 µl dan ditambahkan pada sumur 2 dan 3

6. Control sel sebanyak 75 µl ditambahkan pada sumur 2 lalu dihomogenkan

7. Test sel sebanyak 75 µl ditambahkan pada sumur 3 lalu dihomogenkan

8. Sumur diinkubasi pada suhu ruang selama 45 – 60 menit.

9. Aglutinasi yang terjadi diamati

10. Sampel yang menunjukan hasil aglutinasi positif dilanjutkan ke uji semi kuantitatif.

Note : control positif dan negatif selalu disertakan dalam setiap uji tanpa perlu diencerkan.

B. Uji Semi Kuantitatif

1. Alat dan bahan disiapkan

2. Setiap komponen kit dan sampel dikondisikan pada suhu kamar

3. Semua reagen dihomogenkan perlahan

4. Sumur mikrotitrasi disiapkan dan diberi label no. 1 sampai 8

5. Pengenceran sampel dibuat pada sumur yang berbeda dengan sumur mikrotitrasi dengan mencampur 190 µl diluents dan 10 µl sampel

6. Sumur mikrotitrasi no. 1 dikosongkan

7. Sumur mikrotitrasi no. 2 – 8 ditambahkan 25µl diluent

8. Pada sumur mikrotitrasi no. 1 dan 2 ditambahkan 25 µl sampel yang telah diencerkan.

9. Campuran pada sumur 2 dipipet 25 µl dan ditambahkan pada sumur 3, lalu dihomogenkan. Begitu seterusnya sampai sumur 8

10. Campuran pada sumur 8 dipipet 25 µl dan dibuang

11. Control sel sebanyak 75 µl ditambahkan pada sumur mikrotitrasi no. 1 lalu dihomogenkan

12. Tes sel sebanyak 75 µl ditambahkan pada sumur mikrotitrasi no. 2-8 lalu dihomogenkan

13. Sumur diinkubasi pada suhu ruang selama 45 – 60 menit

14. Aglutinasi yang terjadi dibaca, dan ditentukan titernya

1.7 Interprestasi Hasil

A. Uji Kualitatif

Hemaglutinasi positif ditandai dengan adanya bulatan berwarna merah dipermukaan sumur, hasil negatif terlihat seperti titik berwarna merah di tengah dasar sumur

Tingkatan aglutinasi:

+4 : bulatan merah merata pada seluruh permukaan sumur

+3 : bulatan merah terdapat di sebagian besar permukaan sumur

+2 : bulatan merah yang terbentuk tidak besar dan tampak seperti cincin

+1 : bulatan merah kecil dan tampak cincin terang

+/- : tampak cincin dengan warna bulatan merah yang samar

- : Tampak titik berwarna merah didasar sumur