PEMERIKSAAN TPHA
(Treponema Pallidum Hemaglutination
Assay)
1.1 Tujuan
1. Mahasiswa dapat melakukan
pemeriksaan TPHA
2. Mahasiswa
dapat mendeteksi adanya antibody
terhadap Treponema palidum dalam
serum pasien secara kualitatif dan semi-kuantitatif
1.2 Metode
Metode yang
digunakan adalah indirek hemaglutinasi
1.3 Prinsip
Antibodi spesifik untuk T.pallidum yang ada di dalam serum pasien akan beraglutinasi dengan
awetan eritrosit burung yang terdapat dalam reageant Plasmatec TPHA yang telah dilapisi
komponen antigenik patogen T.pallidum
(Nichol Strain) dan menunjukkan pola
aglutinasi pada sumur mikrotitrasi.
1.4 Dasar Teori
Pemeriksaan Treponema Pallidum Hemagglutination Assay (TPHA)
Treponema Pallidum Hemagglutination
Assay (TPHA) merupakan suatu pemeriksaan serologi untuk sifilis dan
kurang sensitif bila digunakan sebagai skrining (tahap awal atau primer)
sifilis. Manfaat pemeriksaan TPHA
sebagai pemeriksaan konfirmasi untuk penyakit sifilis dan mendeteksi
respon serologis spesifik untuk Treponema
pallidum pada tahap lanjut atau akhir sifilis. Untuk
skirining penyakit sifilis biasanya menggunakan pemeriksaan VDRL atau RPR
apabila hasil reaktif kemudian dilanjutkan dengan pemeriksaan TPHA sebagai
konfirmasi (Vanilla, 2011).
TPHA merupakan tes yang
sangat spesifik untuk melihat apakah adanya antibodi terhadap treponema. Jika
di dalam tubuh terdapat bakteri ini, maka hasil tes positif. Tes ini akan
menjadi negatif setelah 6 - 24 bulan setelah pengobatan. Bakteri-bakteri yang
lain selain keluarga treponema tidak dapat membuat hasil tes ini menjadi
positif (Anonim, 2013).
Pemeriksaan TPHA
dilakukan berdasarkan adanya antibodi Treponema
Palidum yang akan bereaksi dengan antigen treponema yang menempel pada
eritrosit sehingga terbentuk aglutinasi dari eritrosit-eritrosit tersebut
(Vanilla, 2011).
Keunggulan metode TPHA
untuk pemeriksaan Sifilis dibandingkan metode lain:
1. Teknik
dan pembacaan hasilnya mudah, cukup spesifik dan sensitive (dapat mendeteksi
titer – titer yang sangat rendah)
2. Bakteri
lain selain dari family Treponema
tidak dapat memberikan hasil positif
Namun, metode TPHA
memiliki beberapa kekurangan, antara lain:
1. Harganya
mahal
2. Pengerjaannya
membutuhkan waktu inkubasi yang lama, hampir 1 jam.
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pemeriksaan TPHA
antara lain :
1. Jangan menggunakan serum yang
hemolisis karena dapat mempengaruhi hasil pemeriksaan.
2. Serum atau plasma harus bebas dari
sel darah dan kontaminasi mikrobiologi
3. Jika terdapat penundaan pemeriksaan,
serum disimpan pada suhu 2-80C dimana dapat bertahan selama 7 hari
dan bila disimpan pada suhu -200C, serum dapat bertahan lebih lama.
4. Serum atau plasma yang beku sebelum
dilakukan pemeriksaan harus dicairkan dan dihomogenkan dengan baik sebelum
pemeriksaan.
5. Reagen harus disimpan pada suhu 2-80C
jika tidak digunakan dan jangan disimpan di freezer.
6. Uji TPHA menunjukkan hasil reaktif
setelah 1-4 minggu setelah terbentuknya chancre.
7. Dalam melakukan pemeriksaan harus
menyertakan kontrol positif dan kontrol negatif
1.5 Alat, Bahan, dan Reagen
A.
Alat
1. Mikropipet 190 µl, 10 µl, 25 µl, dan
75 µl
2. Microplate
3. Yellow tip
B.
Bahan
1.
Serum
C.
Reagen
1.
Plasmatec
TPHA Test Kit mengandung:
-
R1 : Test sel
-
R2 : Control sel
-
R3 : Diluent
-
R4 : Control positif
-
R5 : Control negatif
1.6 Langkah Kerja
A. Uji
Kualitatif
1. Alat dan bahan disiapkan
2. Setiap komponen kit dan sampel dikondisikan
pada suhu kamar.
3. Semua reagen dihomogenkan perlahan
4. Diluents ditambahkan sebanyak 190 µl
dan sampel ditambahkan sebanyak 10µl pada
sumur 1 lalu dihomogenkan
5. Campuran pada sumur 1 dipipet
sebanyak 25 µl dan ditambahkan pada sumur 2 dan 3
6. Control sel sebanyak 75 µl
ditambahkan pada sumur 2 lalu dihomogenkan
7. Test sel sebanyak 75 µl ditambahkan
pada sumur 3 lalu dihomogenkan
8. Sumur diinkubasi pada suhu ruang
selama 45 – 60 menit.
9. Aglutinasi yang terjadi diamati
10. Sampel yang menunjukan hasil
aglutinasi positif dilanjutkan ke uji semi kuantitatif.
Note
: control positif dan negatif selalu disertakan dalam setiap uji tanpa perlu
diencerkan.
B. Uji
Semi Kuantitatif
1. Alat dan bahan disiapkan
2. Setiap komponen kit dan sampel dikondisikan
pada suhu kamar
3. Semua reagen dihomogenkan perlahan
4. Sumur
mikrotitrasi disiapkan dan diberi label no. 1 sampai 8
5. Pengenceran
sampel dibuat pada sumur yang berbeda dengan sumur mikrotitrasi dengan
mencampur 190 µl diluents dan 10 µl sampel
6. Sumur
mikrotitrasi no. 1 dikosongkan
7. Sumur
mikrotitrasi no. 2 – 8 ditambahkan 25µl diluent
8. Pada
sumur mikrotitrasi no. 1 dan 2 ditambahkan 25 µl sampel yang telah diencerkan.
9. Campuran
pada sumur 2 dipipet 25 µl dan ditambahkan pada sumur 3, lalu dihomogenkan. Begitu
seterusnya sampai sumur 8
10. Campuran
pada sumur 8 dipipet 25 µl dan dibuang
11. Control
sel sebanyak 75 µl ditambahkan pada sumur mikrotitrasi no. 1 lalu dihomogenkan
12. Tes
sel sebanyak 75 µl ditambahkan pada sumur mikrotitrasi no. 2-8 lalu
dihomogenkan
13. Sumur
diinkubasi pada suhu ruang selama 45 – 60 menit
14. Aglutinasi
yang terjadi dibaca, dan ditentukan titernya
1.7 Interprestasi Hasil
A. Uji
Kualitatif
Hemaglutinasi positif ditandai dengan
adanya bulatan berwarna merah dipermukaan sumur, hasil negatif terlihat seperti
titik berwarna merah di tengah dasar sumur
Tingkatan aglutinasi:
+4 :
bulatan merah merata pada seluruh permukaan sumur
+3 :
bulatan merah terdapat di sebagian besar permukaan sumur
+2 :
bulatan merah yang terbentuk tidak besar dan tampak seperti cincin
+1 :
bulatan merah kecil dan tampak cincin terang
+/- :
tampak cincin dengan warna bulatan merah yang samar
- :
Tampak titik berwarna merah didasar sumur
B. Uji
Semi Kuantitatif
Titer : pengenceran tertinggi
yang masih menunjukkan aglutinasi
|
Sumur
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
|
Titer
|
(control
cell)
|
1:80
|
1:160
|
1:320
|
1:640
|
1:1280
|
1:
2560
|
1:
5120
|
