Teknik Pengecatan Gram

1.1  Waktu dan tempat

Waktu praktikum :

-          Pertemuan I : Jumat, 17 Februari 2012

-          Pertemuan II: Kamis, 23 Februari 2012

Tempat Praktikum : Lab Bakteriologi Jurusan Analis Kesehatan Poltekkes Denpasar

1.2  Alat dan Bahan

1.2.1        Pewarnaan Gram Preparat

Alat	Bahan
1.      Ose 2.      Pinset 3.      Api Bunsen 4.      Objek glass 5.      Rak pewarnaan 6.      Label / pensil kaca	1.      Biakan bakteri 2.      Carbol gentian Violet (gram I) 3.      Lugol (gram II) 4.      Alkohol 96% (gram III) 5.      Safranin (gram IV) 6.      Aquades

1.2.2        Pembacaan Preparat

Alat	Bahan
1.      Mikroskop	1.      Preparat yang telah dicat gram 2.      Oil imersi 3.      Tissue lensa

1.3  Prosedur kerja

1.3.1        Pewarnaan Gram Preparat

·   Pembuatan Sediaan

a.       Kaca objek diambil, lalu dibersihkan dan diberi label (nama mhs, NIM)

b.      Ose diambil dan dipanaskan dalam api Bunsen

c.       Ditetesi sedikit aquades pada kaca objek yang akan diletakkan kuman

d.      Tutup wadah biakan dibuka:

-       Untuk suspensi, diambil 1 ose suspense kuman

-       Untuk koloni, diambil 1 ose koloni kuman

e.       Kuman dihapuskan pada kaca objek dengan pola memutar dari dalam keluar

f.       Kaca objek yang telah terisi kuman diletakkan dalam posisi miring dan dikeringkan pada suhu kamar (tidak dipaksa kering)

g.      Ose dan tabung dipanaskan kembali lalu ditutup

·   Fiksasi

Fiksasi dilakukan dengan cara mengelilingi kaca preparat pada api Bunsen sebanyak 3 kali.

·   Pewarnaan

1. Preparat yang telah siap dicat, digenangi dengan cat Gram I selama 1 menit
2. Cat dibuang, lalu preparat dicuci dengan aquades
3. Preparat digenangi cat Gram II selama 1 menit
4. 1. Preparat ditetesi dengan cat Gram III selama ½ menit sampai warna cat tepat dilunturkan.  
      
      
      Cat dibuang, lalu preparat dicuci dengan aquades
      Preparat digenangi dengan cat Gram IV selama ½  – 1 menit
      Sisa cat dibuang lalu preparat dikeringkan di udara
      Preparat siap diamati dibawah mikroskop

1.3.2        Pengamatan Preparat

1.      Mikroskop disiapkan diatas meja kerja yang rata dan kokoh

2.      Posisi duduk disesuaikan (ergonomi) yang baik agar tidak mengganggu pemangamatan

3.      Mikroskop dihidupkan dengan menekan tombol On/Off di mikroskop

4.      Lampu dihidupkan lalu diatur sampai terlihat 1 lapang pandang pada lensa okuler

5.      Kaca objek diletakkan pada meja objek di mikroskop

6.      Lensa objek diatur pada posisi pembesaran 10x.

7.      Makrometer dinaikan full ke atas, lalu diturunkan perlahan sambil objek diamati sampai menemukan lapang pandang

8.      Setelah menemukan lapang pandang focus mata kanan dan kiri diatur dengan cincin diopter pada lensa okuler

9.      Diafragma dibuka pada posisi 70-100 sesuai kenyamanan praktikan

10.  Kondensor dinaikan sampai mendekati meja objek

11.  Objek ditetesi minyak imersi sebanyak 1 tetes

12.  Lensa objektif diputar ke pembesaran 100x.

13.  Micrometer diatur sampai objek ditemukan dengan jelas dengan lensa okuler.

14.  Bakteri diidentifikasi: Bakteri gram positif berwarna ungu dan gram negative berwarna merah.

BAB IV

PEMBAHASAN

1.1  Data Hasil Pengamatan

·      Pewarnaan Gram Preparat

Sebelum diwarnai                               Setelah diwarna

 

      Preparat tidak berwarna                                  Preparat berwarna merah

·      Pengamatan Preparat

Preparat 1                                                        Preparat 2

 

Ciri – ciri :                                                         Ciri – ciri:

Bentuk  : Cocus, sthaphylococus                      Bentuk            : basil  

Warna   : Merah                                                Warna  : merah

Sifat      : Bakteri Gram Negatif                       Sifat    : Bakteri gram negatif

Penataan: Bergerombol                                    Penataan: Bergerombol

1.2  Pembahasan

Bakteri

Bakteri adalah domain yang terdiri dari makhluk hidup yang tidak memiliki membran inti (prokariota). Bakteri memiliki ciri-ciri antara lain tidak memiliki membran inti, tidak memiliki organel bermembran, memiliki dinding sel peptidoglikan, dan materi asam nukleatnya berupa plasmid. Bakteri dapat dikelompokan berdasarkan pewarnaanya. Misalnya dengan metode pewarnaan gram, bakteri dibagi menjadi bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.

-          Bakteri Gram positif mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan. Permeabilitas dinding sel kurang, dan kompleks kristal yodium tidak dapat keluar.

-          Bakteri Gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis, hanya 1 – 2 lapisan dan susunan dinding selnya tidak kompak. Permeabilitas dinding sel lebih besar sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks kristal yodium.

Pewarnaan Gram Preparat

Bakteri umumnya tidak memiliki pigmen sehingga tidak berwarna dan hampir tidak kelihatan karena tidak kontras dengan medium dimana mereka hidup. Oleh karena itu, perlu dilakukan pewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati dengan mikroskop. Dalam pengamatan ini, digunakan tehnik pewarnaan gram untuk mewarnai bakteri yang diambil dari koloni bakteri pada media SSA (Salmonella shigela Agar) dan MCA (Mac Conkey Agar).

Pewarnaan Gram merupakan salah satu langkah awal mengidentifikasi sel bakteri yang memisahkan bakteri menjadi 2 kelompok yaitu bakteri Gram positif (berwarna ungu/biru) dan bakteri Gram negatif (berwarna merah). Perbedaan 2 kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh alkohol.

Reagen-reagen yang digunakan dalam pewarnaan gram adalah:

1.      Larutan Carbol gentian Violet (1 tetes) sebagai cat utama yang akan diikat oleh peptidoglikan bakteri.

2.      Lugol/Iodin (1 tetes) sebagai mordan untuk mengintensifkan cat utama

3.      Ethanol 96% (secukupnya sampai cat utama luntur), sebagai bahan peluntur untukk melunturkan cat utama

4.      Safranin/fuchsin (1 tetes) sebagai cat penutup untuk mewarnai kembali sel-sel yang sudah kehilangan warna cat utamanya

Pada saat pemberian larutan cat kristal violet, bakteri gram positif dan negatif sama-sama berwarna ungu. Saat ditetesi lugol, pada gram positif terbentuk kompleks lugol kristal violet sehingga sel berwarna biru, demikian juga gram negatif. Namun setelah pencucian dengan etanol warna ungu yang diikat oleh bakteri gram negatif luntur, sedangkan pada bakteri gram positif tidak. Pada gram negatif lemak terekstraksi dari dinding sel sehingga pori membesar dan kompleks violet kristal-lugol keluar sel, sedangkan pada gram positif dinding sel dehidrasi, pori berkerut dan permeabilitas rendah sehingga kompleks violet kristal-lugol terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma sehingga sel tetap biru/ungu. Saat penambahan safranin, bakteri gram negatif mengikatnya sedangkan gram positif melewatkannya.

Sebelum dilakukan pewarnaan preparat, dilakukan tahap fiksasi yang dimana bertujuan untuk:

-       Melekatkan bakteri pada objek

-       Mematikan / menonaktifkan mikroorganisme (bakteri)

-       Mengawetkan mikroorganisme yang ada di atas slide.

Keuntungan dan kerugian dari pewarnaan gram preparat:

Kelebihan :

1.      Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri terhadap antibiotik).  Hal ini karena bakteri Gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika.

2.      Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik. Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana) uretral, maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonore.

Kekurangan :

Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 10⁴ per ml.  Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut.  Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis.

Pengamatan Preparat

Pengamatan dengan mikroskop harus dilakukan dengan hati – hati dan teliti, hal ini karena pengamatan berhubungan dengan benda yang mahal dan rawan kerusakan. Posisi duduk dan pengaturan mikroskop sangat mempengaruhi ketelitian dari praktikan.

 Saat pengamatan bakteri dengan mikroskop, dapat diamati 4 hal, yaitu:

·      Bentuk

Morfologi mikroskopik adalah karakteristik bakteri yang dilihat melalui pengamatan dibawah mikroskop. Bentuk bakteri sangat bervariasi, tetapi secara umum ada 3 tipe, yaitu :

1.      Bentuk batang / basil.

Dibedakan atas:

-       Basil tunggal, berupa batang tunggal, contohnya Escherchia coli dan Salmonella typi.

-       Diplobasil; berbentuk batang bergandengan dua – dua.

-       Streptobasil; berupa batang bergandengan seperti rantai, contohnya Streptobacillus moniliformis dan Azotobacter sp.

2.      Bentuk bulat / kokus

Bakteri berbentuk bulat (kokus = sferis/tidak bulat betul) dibagi mejadi bentuk – bentuk sebagai berikut:

-       Monokokus,berbentuk bulat, satu – satu, contohnya Monococcus gonorhoe.

-       Diplokokus, bentuknya bulat bergandengan dua – dua, misalnya Diplococcus pneumonia.

-       Streptokokus, memiliki bentuk bulat bergandengan seperti rantai, sebagai hasil pembelahan sel kesatu atau dua arah dalam satu garis.

-       Tetrakokus, berbentuk bulat terdiri 4 sel yang tersusun dalam bentuk bujur sangkar sebagai hasil pembelahan sel kedua arah.

-       Sarkina, berbentuk bulat terdiri atas 8 sel yang tersusun dalam bentuk kubus sebagai hasil pembelahan sel ketiga arah, contohnya Sarcia sp.

-       Stafilokokus, berbentuk bulat, tersusun seperti kelompok buah anggur sebagai hasil pembelahan sel ke segala arah.

-       Mikrococcus, jika kecil dan tunggal

3.      Bentuk spiral / spirilium.

Di bagi menjadi:

-    Koma (vibrio); berbentuk lengkungan kurang dari setengah lingkaran, contoh nya Vibrio coma, penyebab penyakit kolera.

-    Spiral; berupa lengkunagn lebih dari setengah lingkaran , contohnya Spirillium minor yang menyebabkan demam dengan perantara gigitan tikus atau hewanpengerat lainnya.

-    Spiroooseta; berupa spiral yang halus dan lentur, contohnya Treponema pallisum, penyebab penyakit sifilis.

·      Warna dan sifat

Dalam pengamatan ini, bakteri diidentifikasikan ke dalam kelompoknya berdasarkan perubahan warnanya.

-          Bakteri gram positif berwarna ungu

-          Bakteri gram negative berwarna merah

·      Penataan

Bakteri dalam pengamatan ini, ditemukan bergerombol atau berkoloni. Variasi bakteri atau koloni bakteri dipengaruhi oleh arah pembelahannya, umur, dan syarat pertumbuhan tertentu misalkan makanan, suhu, dan keadaan yang tidak menguntungkan bakteri.